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技術(shù)文章
一、 細胞培養(yǎng)基的概念和原理
合成細胞培養(yǎng)基是用化學成分明確的試劑配制的培養(yǎng)基，組分穩(wěn)定，主要包括糖類、必需氨基酸、維生素、無機鹽類等。自1950 年199 細胞培養(yǎng)基問世以來，合成細胞培養(yǎng)基發(fā)展至今已有幾十種，除了沿用半個世紀的基礎合成細胞培養(yǎng)基之外，近年來還出現(xiàn)了營養(yǎng)成分更加豐富的低血清細胞培養(yǎng)基。
由于細胞種類和培養(yǎng)條件不同，適宜的合成細胞培養(yǎng)基也不同，在動物細胞培養(yǎng)中常用基礎細胞培養(yǎng)基有6～7 種，如BME、MEM、DMEM、HAM F12、PRMI1640、199 等。
由于天然培養(yǎng)基的一些營養(yǎng)成分不能被合成細胞培養(yǎng)基代替，因此一般需在合成細胞培養(yǎng)基中添加5％～10％的小牛血清。小牛血清的加入對細胞培養(yǎng)非常有效，但小牛血清的成分復雜，這對培養(yǎng)產(chǎn)物的分離純化和檢測會帶來一定的不便，為減少小牛血清的影響，開發(fā)了營養(yǎng)成分更加豐富的低血清細胞培養(yǎng)基，可以將小牛血清的使用量降低到1～3％。
無血清細胞培養(yǎng)基（serum free medium， SFM）是指在使用中無需添加血清的細胞培養(yǎng)基，且其組成成分不含有任何動物組分。按照其組分分類，還可以分為無動物組分無血清細胞培養(yǎng)基和化學限定無血清細胞培養(yǎng)基，前者組分中可能含有某些植物來源成分，而后者由化學成分明確的組分組成。
其中，無動物組分無血清細胞培養(yǎng)基是目前在生物制藥行業(yè)中應用廣泛的，它提高了細胞培養(yǎng)的質(zhì)量，避免了使用血清帶來的麻煩。目前，已有多種無血清培養(yǎng)基上市，如雜交瘤細胞無血清培養(yǎng)基、CHO細胞無血清培養(yǎng)基、Vero細胞無血清培養(yǎng)基和NS0 細胞無血清培養(yǎng)基等。無血清培養(yǎng)基通常添加生長附加成分，如激素與生長因子、低分子營養(yǎng)成分和轉(zhuǎn)鐵蛋白等促細胞生長的附加成分，一般包括胰島素、孕酮、硒...酸NA、腐胺、轉(zhuǎn)鐵蛋白等。
2.1 天然培養(yǎng)基
天然培養(yǎng)基是指來自動物體液或利用組織分離提取的一類培養(yǎng)基，如血漿、血清、淋巴液、雞胚浸出液等。組織培養(yǎng)技術(shù)建立早期，體外培養(yǎng)細胞都是利用天然培養(yǎng)基。但是由于天然培養(yǎng)基制作過程復雜、批間差異大，因此逐漸被合成培養(yǎng)基所替代。
2.1.1 小牛血清
用于細胞培養(yǎng)的血清主要是牛血清，培養(yǎng)某些特殊細胞也用人血清、馬血清等。選擇用牛血清培養(yǎng)細胞的原因主要是來源充足、制備技術(shù)成熟、經(jīng)過長時間的應用考驗人們對其有比較深入的理解。牛血清分為小牛血清、新牛血清、胎牛血清。小牛血清取自出生10～30 天的小牛；新牛血清取自出生24小時之內(nèi)的新生牛；胎牛血清應取自剖腹產(chǎn)的胎牛。顯然，胎牛血清是品質(zhì)很高的，因為胎牛還未接觸外界，血清中所含的抗體、補體等對細胞有害的成分最少。
牛血清對絕大多數(shù)哺乳動物細胞都是適合的，但并不排除在培養(yǎng)某種細胞時使用其他動物血清更合適。牛血清中含有豐富的細胞生長必須的營養(yǎng)成份，具有極為重要的功能。
1) 血清主要作用
(1) 提供基本營養(yǎng)物質(zhì)：氨基酸、維生素、無機物、脂類物質(zhì)、核酸衍生物等，是細胞生長必須的物質(zhì)。
(2) 提供激素和各種生長因子：胰島素、腎上腺皮質(zhì)激素（氫化可的 松、地塞米松）、類固醇激素（雌二醇、睪酮、孕酮）等。生長因子如成纖維細胞生長因子、表皮生長因子、血小板生長因子等。
(3) 提供結(jié)合蛋白：結(jié)合蛋白作用是攜帶重要的低分子量物質(zhì)，如白蛋白攜帶維生素、脂肪、以及激素等，轉(zhuǎn)鐵蛋白攜帶鐵。結(jié)合蛋白在細胞代謝過程中起重要作用。
(4) 提供促接觸和伸展因子使細胞貼壁免受機械損傷，對培養(yǎng)中的細胞起到某些保護作用。
2) 優(yōu)點和缺點
血清是非常復雜的混合物，成分多樣，含有各種生理平衡的分子量差別很大的生物分子，有的對細胞生長有促進作用，如含有攜帶激素、礦物質(zhì)、微量元素和脂類物質(zhì)的轉(zhuǎn)運蛋白等。血清能夠提供細胞貼壁因子和擴散因子。血清中含有起穩(wěn)定作用和解毒的因子，能夠維持培養(yǎng)基的pH 值并抑制蛋白酶直接或間接的酶解。但是血清的加入也帶來了很多問題：
(1) 血清的成份可能有幾百種之多，目前對其準確的成份、含量及其作用機制仍不清楚，尤其是對其中一些多肽類生長因子、激素和脂類等尚未充分認識，這給研究工作帶來許多困難；
(3) 不能排除血清中含有易變物質(zhì)，這被認為是“瓶中惡化"的原因之一。
(4) 對大多數(shù)細胞，在體內(nèi)狀態(tài)，血清不是它們接觸的生理學液體，只是在損傷愈合以及血液凝固過程中才接觸血清，因此使用血清有可能改變某種細胞在體內(nèi)的正常狀態(tài)，血清可能促進某些細胞的生長（成纖維細胞）同時抑制另一類細胞生長（表皮細胞）。
(5) 血清含一些對細胞產(chǎn)生毒性的物質(zhì)，如多胺氧化酶，能與來自高度繁殖細胞的多胺反應（如精胺、亞精胺）形成有細胞毒性作用的聚精胺。補體、抗體、細菌毒素等都會影響細胞生長，甚至造成細胞死亡。
(6) 取材中可能帶入支原體、病毒，對細胞產(chǎn)生潛在影響。
(7) 血清的使用使得實驗和生產(chǎn)的標準化困難，其中的蛋白質(zhì)使得某些轉(zhuǎn)基因蛋白生物藥品生產(chǎn)中分離純化工作很難完成。
(8) 大規(guī)模生產(chǎn)中，血清來源越來越困難，價格昂貴，是構(gòu)成生產(chǎn)成本的主要部分之一。
(9) 為了使與傳染源相關(guān)的風險減少到很低，存在多個國家間限制進出口生物材料的國際法規(guī)。
2.1.2 水解乳蛋白
水解乳蛋白（Lactalbumin Hydrolysate ）為乳白蛋白經(jīng)蛋白酶和肽酶水解的產(chǎn)物，含有豐富的氨基酸。既可用于細菌微生物培養(yǎng)，又可用于動物細胞培養(yǎng)。細胞培養(yǎng)中一般為0.5％水解乳蛋白（經(jīng)平衡鹽溶解）與合成培養(yǎng)基（如MEM）按1:1混合使用。
目前在生產(chǎn)中主要用于低鼠腎細胞等細胞的培養(yǎng)和維持。但是水解乳蛋白的使用也給生物制品的生產(chǎn)帶來一定的風險。首先由于水解乳蛋白系或者制品帶來風險。其次水解乳蛋白及含有動物組分培養(yǎng)基的使用，使生物制品下游處理變得復雜，這對于蛋白質(zhì)藥物顯得更加重要。因為從動物細胞中生產(chǎn)生物藥品，其面臨的最大困難就是如何去除內(nèi)源或同源蛋白。不確定的成分，像動物肽類物質(zhì)的引入，勢必會增加提取、分離、純化的步驟，一方面使成本提高，另一方面也會影響生物制品的產(chǎn)量和質(zhì)量。
2.2平衡鹽溶液
一些BSS含有的Ca2+、Mg2+是細胞膜的重要組成成分，同時參與許多重要的細胞功能活動。但它們有使細胞凝集的作用，在配制分散細胞的消化液和特殊用途的細胞洗滌時，宜采用Ca2+、Mg2+含量較低的Dulbecco液或無Ca2+、Mg2+的D-Hanks液，或者PBS液。
2.3基礎培養(yǎng)基
2.3.1 概述
基礎細胞培養(yǎng)基主要包括199、MEM、RPMI-1640、DMEM 、DMEM/F12等。主要成分是氨基酸、維生素、碳水化合物、無機鹽和其它一些輔助物質(zhì)。人工合成培養(yǎng)基使用時還需添加一定量的血清使細胞生長和繁殖
2.3.2 組成及作用
氨基酸：組成蛋白質(zhì)的基本單位。不同的細胞對氨基酸的需求各異，但幾種必需氨基酸細胞自身不能合成，必須依靠培養(yǎng)液提供，如組氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、賴氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、蘇氨酸、色氨酸、纈氨酸、半胱氨酸、酪氨酸等。其余非必需氨基酸，細胞可以自己合成，或通過轉(zhuǎn)氨作用由其他物質(zhì)轉(zhuǎn)化而來。絕大部分細胞對谷氨酰胺有較高的要求，因為谷氨酰胺是作為能源
及碳源物質(zhì)同時被細胞利用，是是細胞合成核酸和蛋白質(zhì)必需的氨基酸，在缺少谷氨酰胺時，細胞生長不良而死亡，所以各種培養(yǎng)液中都含有較多的谷氨酰胺。細胞所能利用的氨基酸是L型同分異構(gòu)體，D型氨基酸不能被利用。
維生素：維持細胞生長的一種生物活性物質(zhì)，對細胞代謝有重大作用。它們在細胞中大多形成酶的輔基或輔酶，沒有它們，酶便沒有活性，代謝活動將無法進行。維生素分為水溶和脂溶兩大類的培養(yǎng)液中直接采用ATP和fu酶A。
葡萄糖：大部分培養(yǎng)基都以葡萄糖作為能量來源之一。
無機鹽：維持培養(yǎng)基滲透壓平衡，參與細胞的代謝活動。主要有Na+、K+、Ca2+、Mg2+等。Na+是細胞外液中最主要的陽離子，對維持滲透壓的恒定有決定性的作用。K+主要分布在細胞內(nèi)液，細胞內(nèi)K+對于激活某些酶是必需的，并在調(diào)節(jié)細胞內(nèi)環(huán)境的酸堿平衡上也有極重要意義。Ca2+在細胞外液中的作用是將組織內(nèi)部細胞之間相互粘著，在細胞內(nèi)參與許多重要的細胞生理活動，如傳導、參與肌肉細胞收縮等。在懸浮培養(yǎng)時，為了減少細胞的聚集和附著，要減少Ca2+的濃度。
Mg2+是構(gòu)成細胞間質(zhì)的重要成分，對于細胞間相互穩(wěn)定結(jié)合有很重要的意義。磷的化合物對細胞物質(zhì)代謝和生理功能調(diào)控有重要作用。
其他成分：肽、核苷、嘌呤等。可幫助細胞的克隆化培養(yǎng)及維持某些特殊細胞系的生長。
2.4 低血清細胞培養(yǎng)基
2.4.1 概述
營養(yǎng)豐富的培養(yǎng)基是維持細胞活性及高密度生長的基礎，營養(yǎng)缺乏容易引起細胞凋亡，新生牛血清中所含大部分營養(yǎng)成分可以通過化學成分明確的營養(yǎng)物質(zhì)如氨基酸維生素等成分組合取代。低血清培養(yǎng)基營養(yǎng)成分大優(yōu)于基礎培養(yǎng)基，僅需添加1％～5％新生牛血清，而對細胞生長、增殖、形態(tài)、活性和功能沒有影響甚至有所改善。
在國外低血清培養(yǎng)基早已有之，如Gibco等。但是他們的低血清培養(yǎng)基是在基礎培養(yǎng)基中選擇性的加入重組胰島素（recombinant insulin）、人源轉(zhuǎn)鐵蛋白（human (holo) tran- sferrin）以及牛血清白蛋白等，有些還包含一些生長因子，這些重組蛋白和動物來源成分對生物制品的安全性有很大影響。成本低。
2.4.3 應用案例
采用199(SLM)、MEM(SLM)和DMEM（SLM）低血清培養(yǎng)基分別培養(yǎng)Vero細胞、BHK21細胞和CHO細胞，新生牛血清用量可以從10％降至3％，減少新生牛血清使用批次和批間差的影響，減少生物制品純化損失，減少由于不確定蛋白或者其它血清組分帶來干擾和差異的風險，提高制品安全性。低血清培養(yǎng)基可以在方瓶、3L轉(zhuǎn)瓶、15L 轉(zhuǎn)瓶及生物反應器中培養(yǎng)細胞，在疫苗生產(chǎn)中可以達到低血清高密度的培養(yǎng)效果。
低血清培養(yǎng)基營養(yǎng)成分優(yōu)于基礎培養(yǎng)基，易使細胞增殖迅速，代謝旺盛，代謝產(chǎn)物對細胞有不良影響，易產(chǎn)生細胞老化脫落現(xiàn)象。因此需要適當增加換液次數(shù)，增加傳代頻率。獲取同樣的細胞量，用低血清培養(yǎng)基將比用傳統(tǒng)培養(yǎng)基縮短近1/3 的時間，可提高生產(chǎn)效率。
采用199(SLM)低血清培養(yǎng)基培養(yǎng)Vero細胞分泌狂犬疫苗病毒，滴度明顯高于采用199 培養(yǎng)基傳統(tǒng)培養(yǎng)獲得的滴度。采MEM(SLM)低血清培養(yǎng)基BHK21細胞，在本實驗情況下12 代內(nèi)細胞形態(tài)和致密度均優(yōu)于MEM培養(yǎng)基傳統(tǒng)培養(yǎng)情況，因而可以預期其產(chǎn)生的口蹄疫、甲肝等疫苗生產(chǎn)的病毒產(chǎn)量將提高。低血清培養(yǎng)基用于反應器Vero細胞狂犬疫苗的生產(chǎn)，實踐證明效果良好。采DMEM（SLM）低血清培養(yǎng)基添加1％小牛血清在轉(zhuǎn)瓶中培養(yǎng)CHO細胞生產(chǎn)EOP，可提高收液次數(shù)，每次收液表達量明顯提高。
2.5無血清細胞培養(yǎng)基
2.5.1 概述
無血清培養(yǎng)基是用來在無血清條件下生長特殊類型的細胞或進行專門應用的培養(yǎng)基。一般是由基礎培養(yǎng)基和替代血清的補充因子組成。無血清培養(yǎng)基中沒有添加血清，但含有個別蛋白或大量蛋白組分。無血清培養(yǎng)基與無蛋白培養(yǎng)基的區(qū)別在于培養(yǎng)基中沒有添加蛋白，但含有一些動物或植物來源成分，如低分子量肽的水解物。還有一種化學限定培養(yǎng)基，培養(yǎng)基中不含有蛋白、水解產(chǎn)物或未知結(jié)構(gòu)的組分，所有成分均有已知的化學結(jié)構(gòu)。
優(yōu)點：
1） 未知組分少；
2） 培養(yǎng)基中不存在血清中的抗體、補體等成分，對培養(yǎng)細胞影響小；
3） 雜蛋白含量少，生產(chǎn)的產(chǎn)品后期處理較容易，例如疫苗生產(chǎn)由于人用疫苗需要純化減少雜蛋白，純化過程中成本消耗很大，疫苗的損失也很大；
4） 無血清培養(yǎng)既可以實現(xiàn)細胞的大規(guī)模懸浮培養(yǎng)，增加培養(yǎng)液的利用率，可以采用發(fā)酵罐培養(yǎng)減少了人力消耗。
缺點：
目前為止不是所有的細胞都能在無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)。無血清培養(yǎng)基的某些組分價格昂貴，導致無血清無法工業(yè)推廣的主要原因
3.2細胞培養(yǎng)基的檢測方法
3.2.1 澄清度
水是細胞培養(yǎng)基的溶劑。細胞培養(yǎng)基中的營養(yǎng)成分只有溶解于水才能被細胞吸收攝取，細胞才能生長增殖，因此細胞培養(yǎng)基是否溶解以及培養(yǎng)液是否透明澄清直接影響培養(yǎng)基使用。該項目是通過對水溶解后的細胞培養(yǎng)基的澄清度檢查，判斷細胞培養(yǎng)基的澄清度。 按中華人民共和國藥典2005年版二部附錄Ⅸ B進行。
3.2.2 pH 值
哺乳類動物細胞生長需要合適的酸堿度，pH過高或者過低都會導致細胞死亡。pH值的測定也可以檢查細胞培養(yǎng)基的批間差。清大天一標準規(guī)定取規(guī)定量供試品，用注射用水（水溫20℃-30℃）溶解至1L，加入規(guī)定量碳酸氫鈉到上述溶液中，用與細胞培養(yǎng)基溶液pH值相近的兩點標準緩沖液校準后的酸度計進行測定。按中華人民共和國藥典2005年版二部附錄Ⅵ H進行；加入規(guī)定量的碳酸氫鈉到上述溶液中，按中華人民共和國藥典2005年版二部附錄Ⅵ H進行
3.2.3 干燥減量的質(zhì)量分數(shù)
細胞培養(yǎng)基具有吸濕性，在空氣中放置水分會很快升高，干燥減量的質(zhì)量分數(shù)表示產(chǎn)品中含濕量。細胞培養(yǎng)基是有菌制劑，其豐富的營養(yǎng)成分有利于微生物生長，控制細胞培養(yǎng)基中的水分可以防止微生物的繁殖，保持細胞培養(yǎng)基的養(yǎng)分。按中華人民共和國藥典2005 年版二部附錄Ⅷ L 干燥失重測定法進行。
3.2.4 滲透壓
溶劑通過半透膜由低濃度向高濃度溶液擴散的現(xiàn)象稱為滲透，阻止?jié)B透所需施加的壓力，稱為滲透壓。細胞必須生活在等滲環(huán)境中，動物細胞借助K＋、Na＋維持滲透平衡。大多數(shù)細胞對滲透壓有一定的耐受性。但是培養(yǎng)液滲透壓過高容易使細胞脫水wei縮，培養(yǎng)液滲透壓過低容易使細胞膨脹破裂，因此要控制培養(yǎng)基的滲透壓范圍。按中華人民共和國藥典2005 年版二部附錄Ⅸ G 滲透壓摩爾濃度測定法進行。
3.2.5 細菌內(nèi)毒素
細菌內(nèi)毒素是許多病原性細菌所產(chǎn)生的毒素。它的特殊性在于不是細菌或細菌的代謝產(chǎn)物，而是細菌死亡或解體后才釋放出來的一種具有生物活性的物質(zhì)。培養(yǎng)基細菌內(nèi)毒素過高，對生物制品疫苗（如狂犬、乙肝疫苗）、基因工程藥品等注射用的藥品都需要檢查細菌內(nèi)毒素。 因此本項目的檢驗符合生物制品質(zhì)量控制要求。常規(guī)細胞培養(yǎng)基的細菌內(nèi)毒素標準定為＜10 EU/ml。稱取本品規(guī)定量（見表4-12）的1/100，加入細菌內(nèi)毒素檢查用水10 mL溶解，吸取該溶液0.1 mL加細菌內(nèi)毒素檢查用水3.9 mL，混勻即得試樣。按中華人民共和國藥典2005 年版二部附錄Ⅺ E 細菌內(nèi)毒素檢查法中的凝膠法進行。
3.2.6 微生物限度
細胞培養(yǎng)基不是無菌產(chǎn)品，其中的微生物在一定條件下會吸收細胞培養(yǎng)基中的營養(yǎng)物質(zhì)滋生繁殖，導致細胞培養(yǎng)基變質(zhì)失效。控制細胞培養(yǎng)基中細菌和霉菌，是延長細胞培養(yǎng)基有效期的方法之一。清大天一在參考《中華人民共和國藥典》2005版二部附錄第100頁的口服給藥制劑的微生物限度標準，并嚴于該標準，規(guī)定細胞培養(yǎng)基產(chǎn)品的細菌數(shù)每1g不得超過200個，霉菌數(shù)每1g不得超過50個。
稱取樣品1 g，加入無菌純化水10 mL溶解，混勻即得試樣。按中華人民共和國藥典2005年版二部附錄Ⅺ J 微生物限度檢查法進行，檢查項目為細菌數(shù)、霉菌數(shù)。檢查法采用平皿法。
3.2.7 細胞生長試驗
這是一個性能特性表述的要求。細胞培養(yǎng)基的功能就是培養(yǎng)哺乳類動物細胞，因此經(jīng)過細胞培養(yǎng)效果的檢驗是產(chǎn)品質(zhì)量優(yōu)劣的直觀表述，這也是很多生物制藥用戶要求的一項指標。目前國內(nèi)尚無細胞培養(yǎng)和計數(shù)的法定方法，可參考《體外培養(yǎng)的原理與技術(shù)》中細胞計數(shù)法中論述的內(nèi)容給出。按產(chǎn)品說明書配制培養(yǎng)液進行細胞培養(yǎng)，前四天用含10％小牛血清的培養(yǎng)液培養(yǎng)，觀察細胞形態(tài)并計數(shù)，檢查細胞培養(yǎng)基是否有促生長的能力。后三天用不含小牛血清的培養(yǎng)液維持培養(yǎng)，觀察細胞形態(tài)并計數(shù)，檢查細胞培養(yǎng)基中是否有不利細胞生長的毒素。本試驗用細胞為VERO細胞。
四、細胞培養(yǎng)基的使用方法細胞培養(yǎng)基的種類繁多，細胞培養(yǎng)方式也較多，如何正確地使用培養(yǎng)基及很大程度地保持培養(yǎng)基的營養(yǎng)以維持細胞的生長，對每個培養(yǎng)者都很重要。培養(yǎng)基的使用依不同的培養(yǎng)基種類、培養(yǎng)方式、細胞種類的不同而存在差異。
4.1 細胞培養(yǎng)液的構(gòu)成
細胞培養(yǎng)液指細胞生長的液體環(huán)境，一般指培養(yǎng)液，添加了血清、水解乳蛋白、各種添加劑等可以直接使用的培養(yǎng)液。
4.1.1 細胞培養(yǎng)基&血清模式
血清對于在傳統(tǒng)培養(yǎng)基配方中生長和增殖的大多數(shù)細胞系來說是需要的，因為大多數(shù)單獨的培養(yǎng)基并不能提供細胞生長所需要的全部營養(yǎng)，如MEM培養(yǎng)基，較為常用的量為5％～10％的比例，而特殊的低血清培養(yǎng)基血清量可降至3％左右，細胞的形態(tài)和功能不受影響。
4.1.2 細胞培養(yǎng)基&乳歐液模式
化學合成培養(yǎng)基現(xiàn)雖已大規(guī)模使用，但在某些培養(yǎng)領域水解乳蛋白仍在使用，以補充培養(yǎng)液中缺乏的氨基酸、小肽物質(zhì)。較為常用的方式是用漢氏（Hanks’ BSS）或歐式(Earle’s BSS)平衡液溶解水解乳蛋白（一般為5‰濃度），即成乳漢（歐）液，再與化學合成培養(yǎng)基（一般為MEM）按比例混合使用（如1：1）。
4.1.3 細胞培養(yǎng)基&各類添加劑（生長因子等）模式
成分復雜的培養(yǎng)基還含有許多化合物，包括蛋白質(zhì)、多肽、核苷、檸檬酸循環(huán)的中間產(chǎn)物、丙酮酸及脂類等。已發(fā)現(xiàn)當培養(yǎng)基中的血清濃度減少時，這些成分都是必需的。既使在使用血清的情況下，這些成分也可幫助細胞的克隆化培養(yǎng)及維持某些特殊細胞系的生長。激素和生長因子在大多數(shù)常規(guī)培養(yǎng)基的配方中都沒有注明，但在無血清培養(yǎng)基中通常要加入它們，用其來代替血清中的激素能增加多種不同類型細胞的貼瓶率；生長因子包括FGF家族、EGF、PDGF、IGF－1和IGF－2及白介素等，生長因子和細胞因子有著廣泛的特異性，一般與激素或其它物質(zhì)起相互協(xié)同或加成作用。另一種常見的添加物就是血清替代物，目前已有許多可替代傳統(tǒng)培養(yǎng)液中血清成分的商業(yè)產(chǎn)品，其穩(wěn)定性較好，但批次間仍有差別，產(chǎn)品的成分也不很確定。
4.2細胞培養(yǎng)基配制
4.2.1 干粉培養(yǎng)基原倍液的配制
1）配制過濾除菌的細胞培養(yǎng)基
(1) 閱讀培養(yǎng)基使用說明，確定需要添加何種添加劑（如NaHCO3、L-谷氨酰胺、丙酮酸鈉、HEPES等）。
(2) 根據(jù)所需將培養(yǎng)基全部倒入一容器中，用少量注射用水（20℃～30℃）將袋內(nèi)殘留培養(yǎng)基洗下，并入容器。加注射用水至總體積的95％，輕微攪拌溶解。
(3) 加入規(guī)定量的碳酸氫鈉及所要添加的物質(zhì)。
(4) 輕微攪拌溶解，加注射用水至規(guī)定體積。
(5) 用1 mol / L 氫氧化鈉溶液或 1 mol / L 鹽酸溶液調(diào)pH至所需值。
(6) 用0.22 μm濾膜正壓過濾除菌。
(7) 溶液應在2℃－8℃下避光保存。
具體使用方法參照培養(yǎng)基包裝袋上的說明書。
2）配制可高壓滅菌細胞培養(yǎng)基
(1) 根據(jù)所需將培養(yǎng)基全部倒入一容器中，用少量注射用水（20℃～30℃）將袋內(nèi)殘留培養(yǎng)基洗下，并入容器。加注射用水至總體積的95％，輕微攪拌溶解
(2) 在121℃、15psi下滅菌15分鐘。
(3) 待溶液冷卻至室溫，加入無菌0.2 mol / L L－谷氨酰胺溶液規(guī)定體積、無菌7.5％（w/v）碳酸氫鈉溶液規(guī)定體積，加注射用水（20℃～30℃）至規(guī)定體積，混勻。
(4) 如果必要，用1 mol / L 氫氧化鈉溶液或 1 mol / L 鹽酸溶液調(diào)pH至所需值。
(5) 溶液應在2℃－8℃下避光保存。
具體使用方法參照培養(yǎng)基包裝袋上的說明書
4.2.2 注意事項
1） 細胞培養(yǎng)用水一般為三蒸水（經(jīng)石英蒸餾器蒸餾）或超純水，醫(yī)藥生產(chǎn)上一般為注射用水。
2） 建議盡量選擇與所用量相匹配的包裝一次使用，因為包裝一旦打開，組分可能會變質(zhì)或因受潮而結(jié)團。
3） 溶解干粉培養(yǎng)基時先加入終體積90％－95％的培養(yǎng)用水，添加劑加完后再補足。
4） 如需添加的組分較多時，某一組分溶解后，再添加另一組分。
5） 待培養(yǎng)基溶解后再加入碳酸氫鈉，以免產(chǎn)生沉淀。
6） 所有成分溶解后，培養(yǎng)基應立即過濾或高壓除菌，以免產(chǎn)生沉淀或有微生物污染。
7） 在過濾除菌時，一般情況下應調(diào)pH比所需值低0.1～0.2個單位，因過濾除菌后，pH值會升高約0.2。
8） 在細胞培養(yǎng)過程中，建議不加或加少量的抗生素，如血清的濃度較低則所加抗生素的量也要相應降低一些。
培養(yǎng)基的滅菌方法主要有兩種，高壓除菌及0.22 um微孔濾膜過濾除菌。與過濾相比，高壓滅菌的工作強度小，相對便宜，失敗率低，但易造成營養(yǎng)成分的流失。
4.3.1 高壓滅菌
某些培養(yǎng)基（如MEM）可進行高壓滅菌，例如清大天一的MEM培養(yǎng)基中的MD605、MD609等。其中不含有L-谷氨酰胺和碳酸氫鈉，可在高壓滅菌后加入。另外可高壓的谷氨酸鹽（如L-丙氨酰-L-谷氨酰胺）可代替L-谷氨酰胺
為保證高壓滅菌的效果，滅菌設備的驗證很關(guān)鍵，可高壓滅菌的培養(yǎng)基在121℃、15psi，15分鐘的條件下可達到滅菌效果及營養(yǎng)成分的最小損失，因此不需將滅菌時間延長。
4.3.2 過濾滅菌
大多數(shù)培養(yǎng)基采用0.1～0.2 μm孔徑的微孔濾膜進行過濾滅菌，并且已成為培養(yǎng)基除菌的發(fā)展方向，它可低限度地減少培養(yǎng)基的營養(yǎng)損失。
4.4 細胞培養(yǎng)液的儲存
細胞培養(yǎng)液的儲存條件一般為2－8℃、密閉、避光保存，但要注意如下幾點：
1） 過濾后的培養(yǎng)液，即添加了血清、谷氨酰胺、抗生素等的培養(yǎng)液要盡快使用，一般在2－3周內(nèi)使用完。培養(yǎng)液中的L-谷氨酰胺是不穩(wěn)定的，不同溫度L－谷氨酰胺的降解。
2） 滅菌后的未加L-谷氨酰胺等添加劑的培養(yǎng)基溶液，一般可在4℃保存6～9個月，也可冷凍保存，用時解凍
3） 高壓除菌后的培養(yǎng)基應置4℃保存，不能因為其可耐受高溫而忽略儲存溫度。
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